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也会引起食品营养流失
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简介芽孢是细菌在环境胁迫如低温、干旱和营养缺乏等)下形成的休眠体。因其独特的结构特性而对高温、高压、干燥、辐射、低温、腐蚀性物质等具有极强的抗性。如何将芽孢杀灭一直是食品杀菌领域亟待突破的关键问题。现阶段 ...
芽孢是枯草细菌在环境胁迫(如低温、干旱和营养缺乏等)下形成的芽孢芽孢休眠体。因其独特的杆菌结构特性而对高温、高压、中胞干燥、壁肽辐射、分的影低温、离纯腐蚀性物质等具有极强的化及抗性。如何将芽孢杀灭一直是其对食品杀菌领域亟待突破的关键问题。现阶段杀灭芽孢主要是枯草靠传统的高温、高压的芽孢芽孢方法,然而高温、杆菌高压在杀灭芽孢的中胞同时,也会引起食品营养流失,壁肽口感、分的影风味等品质的严重下降。如何在常温下杀灭芽孢一直是食品领域研究人员的一大挑战。研究发现,当芽孢萌发后,其抗性消失,这也为杀灭芽孢提供了一个有效策略。如今,先萌发后杀灭是杀灭芽孢的一个最有效途径。
肽聚糖是细菌细胞壁的主要成分,由N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和N-乙酰胞壁酸(MurNac)通过β-1,4糖苷键连接聚合而成。与MurNac相连的依次是L-Ala,γ-Glu,m-Dpm和D-Ala。革兰氏阴性菌和阳性菌的主要区别在第3个氨基酸,大多数阳性菌的第3个氨基酸是L-Lys。胞壁肽是肽聚糖酶解后产物。研究表明,含有Dpm的胞壁肽是一种有效的萌发剂,能促进芽孢萌发。最小的有效结构单元的胞壁肽为二糖三肽,其二聚体或三聚体依然能诱导芽孢萌发。现如今,国内还没有关于胞壁肽分离纯化的报道,也没有关于胞壁肽对芽孢萌发的影响研究。本文通过酶解等方法成功分离纯化了胞壁肽,研究胞壁肽对于芽孢萌发的影响,为后续研究奠定基础。
1材料与方法
1.1试验材料
枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis168),购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。
1.2试验试剂
LB液体培养基,北京索莱宝科技有限公司;BacterialAgar(BD);α-淀粉酶、胰蛋白酶、变溶菌素,购买自美国Sigma公司;其它试剂均为分析纯。
1.3仪器及设备
倒置荧光显微镜,德国蔡司公司;高效液相色谱,日本岛津公司;超高效液相-质谱联用仪,美国沃特世公司;电热恒温培养箱,上海一恒科技有限公司;傅里叶变换红外光谱扫描仪,美国铂金埃尔默公司;500兆核磁共振谱仪,瑞士布鲁克公司;压力蒸汽灭菌锅,上海申安医疗器械厂;多功能酶标仪,瑞士帝肯公司;均质破碎仪,美国Fastprep24;冷冻离心机,日本日立公司。
1.4试验方法
1.4.1枯草芽孢杆菌芽孢的制备
菌种先用LB琼脂培养基活化3代以上,接入2×SG培养基中涂板培养。在37℃培养2d后,用相差显微镜镜检芽孢,当视野中大部分芽孢从母细胞中脱落后,用冷的无菌去离子水将培养基上的芽孢清洗收集到离心管中,离心条件为8000g、4℃、10min,离心数次。离心过程中保证全程在低温条件中进行。离心后除去上清液,获得的芽孢沉淀重悬于ACES缓冲液(0.05mol/L,pH7.0)中,最后用相差显微镜镜检,视野中≥95%的芽孢呈现明亮状方可使用。芽孢浓度约为1.0×108CFU/mL,存放于4℃冰箱,1个月内使用。
1.4.2芽孢平板计数
将芽孢悬浮液进行梯度稀释,枯草芽孢杆菌芽孢采用营养琼脂培养基进行倾注平板计数,每个平板中加入1mL稀释菌液。枯草芽孢杆菌芽孢在37℃条件下进行培养,培养24h。杀菌效果用芽孢减少的对数表示:lg(Nt/N0),其中,Nt为处理后存活的菌落数,N0为处理前菌落总数。
1.4.3芽孢萌发试验
吸取适量芽孢液于离心管中,加入适量萌发剂。放置在摇床中培养1h(37℃,200r/min)。之后将芽孢液放入80℃水浴中加热20min。平板计数计算芽孢萌发率。
1.4.4肽聚糖的提取
采用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis168)的细胞壁提取肽聚糖。购买的菌种在液体培养基中活化3代后使用。将枯草芽孢杆菌接种到LB琼脂培养基上,于37℃培养24h。取新鲜单菌落接种到适量的LB液体培养基中培养至OD600约1.0,离心收集菌体(8000×g、4℃、10min),用冷的无菌去离子水清洗2次。将沉淀重新悬浮于8%SDS溶液中,煮沸30min,离心(13000×g,15min,25℃)收集沉淀,清洗数次直至除去残留的SDS。SDS处理除去了菌体的其它蛋白质,非共价结合的脂蛋白和脂多糖。将沉淀溶于无菌去离子水中均质破碎仪破碎细菌,不溶性细胞壁组分再通过离心收集(40000×g,30min,25℃)。收集的不溶性细胞壁进一步用α-淀粉酶、胰蛋白酶进行酶解,以除去细胞壁上的糖原、共价结合的蛋白质。以上两步酶解均在缓冲液中进行(10mmol/LTris-HCl,pH8.0),在胰蛋白酶中需要加入10mmol/LCaCl2。将酶解液加入SDS(终质量分数1%)煮沸钝化胰蛋白酶,并清洗除去SDS。将细胞壁重新悬浮于氢氟酸(5mg细胞壁悬浮于2mL48%HF)中,4℃处理48h。HF可以除去肽聚糖上磷酸二酯键共价连接的次生细胞壁多糖,包括磷壁酸、poly-(β,1-6GlcNAc)等。细胞壁组分再分别采用8mol/LLiCl和0.1mol/LEDTA清洗,无菌水清洗2次,最后采用丙酮除去脂磷壁酸和脂多糖。将样品冻干,得到肽聚糖。
1.4.5胞壁肽分离纯化
将提取的肽聚糖悬浮于12.5mmol/L磷酸盐缓冲液(1mmol/LMgCl2,pH6.0,0.02%叠氮化钠)中,加入5μg/mL变溶菌素,于37℃酶解24h。酶解的胞壁肽需要采用硼氢化钠还原,防止Cl的异构化。将胞壁肽悬浮于100mL0.5mol/L的硼酸盐缓冲液(pH9.0)中。胞壁肽还原采用新鲜配制的25mL,25mg/mLNaBH4,在加入过程中使pH保持在9.0。还原反应在室温中保持15min并不停地振荡,加入H3PO4使反应终止,将pH调至4。所得样品保存在-20℃。还原的胞壁肽采用HPLC(Shimadzu)分离,ODS色谱柱(Hypersiloctadecylsilanecolumn,250mm×4.6mm,颗粒:5μm,30105-254630,ThermoFisherScientific)。洗脱液分别是:A,40mmol/L磷酸钠(pH4.5);B,40mmol/L磷酸钠(pH4.0)并加入20%(体积分数)甲醇。A、B流动相中加入0.00025%的叠氮化钠。色谱柱平衡柱子采用流动相A,柱温52℃,流速0.5mL/min,平衡1h。可溶性胞壁肽进样100μL,进样5min后,洗脱程序为B流动相以线性梯度从0到100%,时间为5min到270min,流动相流速保持在0.5mL/min。胞壁肽组分检测采用紫外检测器,波长为206nm
1.4.6胞壁肽组分脱盐
胞壁肽组分冻干后重新悬浮于无菌超纯水中,采用HPLC法进行脱盐,色谱柱为前述分离柱。柱子采用0.007%(体积分数)三氟乙酸平衡,柱温35℃,流速1mL/min,胞壁肽采用50%甲醇(0.0025%三氟乙酸)线性梯度(0~100%)洗脱,洗脱时间在30~50min之间,胞壁肽组分检测采用紫外检测器,波长为206nm。
1.4.7三重四级杆串联质谱鉴定
脱盐的胞壁肽组分采用三重四级杆串联质谱仪(QuattroMicro,Micromass)进行鉴定。全扫描模式(MSScan)质谱条件:正离子(ESI+)数据采集模式产生准分子离子峰[M+H]+;m/z扫描范围100~2000u;毛细管电压3.5kV;锥孔电压40V;萃取电压5.0V;离子源温度110℃;脱溶剂温度450℃;脱溶剂气650L/h;锥孔反吹气50L/h;RF透镜电压0.5V。
1.4.8红外扫描光谱
采用压片法将1.5mg冻干的GM-TriDAP与200mg干燥的KBr在玛瑙研钵中混合研磨均匀,置于磨具中,用压片机进行压片(压力为20~30MPa)1min,取下后得到透明的样品薄片,用傅里叶变换红外谱仪进行红外光谱的扫描,扫描范围4000~500cm-1。
1.4.91HNMR
将2mg冻干的GM-TriDAP样品溶于1mLD2O中,冷冻干燥并重复3次将糖肽中的活泼H置换,溶于0.5mLD2O中后置于核磁管中,核磁共振分析采用500兆核磁共振谱仪,室温20℃,500MHz作氢谱。
1.5数据统计与分析
所有试验均重复3次。绘图使用Origin8.5软件。
声明:本文所用图片、文字来源《中国食品学报》,版权归原作者所有。如涉及作品内容、版权等问题,请与本网联系
相关链接:肽聚糖,N-乙酰胞壁酸,三氟乙酸,枯草芽孢杆菌
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